产品目录

本试剂盒适用于快速提取各种全血/血浆/液体样本miRNA和其它各种小RNA。本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解全血（液体样本）和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。
  
• 独有的裂解液配方，可直接裂解全血，不需要先裂解去除红细胞。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• RNase-free H2O(序号②)第一次使用前加入21mL无水乙醇，配制成70%乙醇。
  
• Wash Solution 1(序号③)第一次使用前加入28mL无水乙醇。
  
• Wash Solution 2/3(序号④)第一次使用前加入42mL无水乙醇。

• Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后，可以在常温保存一个月，如果要更长时间保存，请存放在4℃，但是使用前，应该先回复到室温。
  
• Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
  
• 运输在常温下进行，不影响使用效果。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 第一次使用前请先在试剂①、②、③中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 需要自备乙醇，氯仿，一次性注射器，研钵。
  
• Lysis buffer和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

• 每0.25mL液体样品加入0.75mL Lysis buffer，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5～10×10⁶个细胞至少加入0.75mL Lysis buffer。对于含有高污染物样品如全血样品，可以用灭菌水按照1：1比例稀释一倍后开始提取。Lysis buffer和液体样品的终体积比总是3∶1。
  
• 将样品剧烈震荡混匀，在15～30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
  
• 每0.75mL Lysis buffer加0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。
  
• 于4℃ 12000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加Lysis buffer体积的70%。
  
• 小心取上清（精确计算体积）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇（必须是室温的），涡旋混匀。此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心，立刻接下步。
  
• 将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm离心30～60秒，弃掉废液。
  
• 加700μL Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入500μL Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL Wash Solution 2/3，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water（事先在100℃水浴中预热效果更好），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
  
• 如果预期RNA产量>30μg，加30～50μL RNase-free water重复步骤10，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    
  • RNA在裂解液中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。
    
    • 将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。
• RNA纯度及浓度检测：
  • 完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
    
  • 纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mM Tris,pH7.5）在1.8～2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
    
  • 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
    
    终浓度(ng/μL)=(OD260)×(稀释倍数n)×40
• microRNA富集方法（仅仅提取microRNA，不包含>200nt其它总RNA成份。）
  
  • 按照前面标准操作步骤1～5操作，直到得到上清。
    
  • 较精确估计上清体积，加入等体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。
    
  • 将混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm离心30～60秒，收集滤过物。将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管内，再加入剩下的混合物，离心，收集滤过物。合并两次滤过物，计算体积。
    
    • 此时，滤过物含有microRNA，吸附柱子上面是除去了microRNA的总RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面标准操作步骤7～10操作漂洗，洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。
  • 较精确估计滤过物体积，加入0.65倍体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。
    
  • 取一套新的microRNA吸附柱MA，将上一步骤混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm离心30秒，弃掉废液。
    
  • 按照前面标准操作步骤7～10操作漂洗，洗脱得到富集的microRNA。
    • 不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用富集方法提取的microRNA。